Caracterização dos gêneros Pestivirus e Hepacivirus com a finalidade de identificação para possível desenvolvimento de kits diagnósticos específicos

Abstract

O vírus da diarreia viral bovina (BVDV) com suas variantes são considerados importantes patógenos na bovinocultura brasileira, e o Hepacivirus bovino (HepBovV) ainda é pouco estudado, e seu impacto na cadeia produtiva desconhecido. A relação genética e antigênica entre esses vírus, devido às reações cruzadas que apresentam, pode representar dificuldade nos métodos diagnósticos. A vacinação é uma das formas de controle de BVDV adotada no país são, porém, vacinas importadas, o que levanta o questionamento para controle efetivo frente às estirpes virais nativas. Quanto ao HepBovV, por ainda ter seu efeito pouco estudado nos animais, não se aventa a necessidade de desenvolver vacina. Os objetivos do presente estudo foram os de identificar bovinos positivos de até 15 meses de idade para BVDV e HepBovV utilizando testes moleculares e imunodiagnósticos que possam auxiliar a identificação de possíveis biomarcadores para BVDV e HepBovV, visando contribuir no desenvolvimento de kits diagnósticos capazes de distinguí-los e verificar as correlações genéticas entre esses vírus da família Flaviviridae. No estudo piloto foram caracterizadas amostras positivas para BVDV pela RT-PCR convencional, sequenciamento e análise filogenética a partir de 683 amostras de sangue total bovino utilizando-se primers da região 5’UTR, sendo identificados pelo sequenciamento de Sanger, seis para HepBovV (99%) e uma amostra para o atípico Hobi-like (Pestivirus H), com 99% de identidade. Esse resultado evidencia que os primers da região 5’UTR para BVDV apresentaram possível reatividade cruzada no teste molecular com HepBovV. Na etapa seguinte, ampliada a amostragem para 9.026 amostras de sangue total bovino, analisadas em pools de cinco amostras, totalizando 1.805 pools, pela técnica de RT-qPCR para BVDV. Para comparação dos resultados com outras metodologias diagnósticas, as amostras positivas na RT-qPCR foram testadas pelo ELISA BVDV antígeno (ELISA-Ag BVDV da IDEXX®) e isolamento viral em cultivo celular seguido de Imunoperoxidase (IPX). Das 9026 amostras de sangue analisadas sob a forma de pool de cinco amostras foram detectados 6,4% (115/1.805) pools positivos, os quais ao serem individualizados revelaram 1,43% (129/9.026) amostras de BVDV positivas. As 129 amostras positivas na RT-qPCR foram submetidas ao teste de ELISA-Ag, o qual confirmou 60 animais positivos, e demonstrou a possível reatividade cruzada com outros Pestivirus na RT-qPCR. No sequenciamento de Sanger identificaram-se os vírus BVDV3 (30) e o HepBovV (1). Foram submetidas ao isolamento em célula MDBK, 123 amostras de sangue total bovino e a avaliação quanto à presença do BVDV foi realizada pela IPX, sendo que 19 isolados apresentaram-se positivos ao BVDV não citopatogênico (NCP), sendo possível confirmar o isolamento do BVDV-1d e do BVDV-3, ambos NCP. Foram incluídos no presente estudo dois fetos de uma propriedade leiteira com problemas reprodutivos, as quais foram positivas no ELISA-Ag e RT-qPCR para BVDV tendo sido identificada a estirpe BVDV-1a pelo sequenciamento de Sanger com 98% de identidade. Formou-se um banco de amostras de sangue, tecidos fetais e vírus isolados em cultivo celular que poderão ser utilizados para o desenvolvimento de novos kits diagnósticos.