Indução do silenciamento gênico para resistência ao vírus da leprose dos citros C, principal agente causal da leprose dos citros

Abstract

A leprose dos citros (LC) é a principal doença viral que acomete a citricultura brasileira. Embora causada por diversos vírus transmitidos por ácaros do gênero Brevipalpus, o vírus da leprose dos citros (CiLV-C, Cilevirus leprosis) é o agente prevalente no país, transmitido principalmente por B. yothersi. Apesar do alto custo, as medidas de controle da LC têm se demonstrado ineficazes devido à interferência com o uso de inseticidas, pouca disponibilidade de diferentes princípios ativos e ocorrência de subpopulações de ácaros Brevipalpus resistentes aos acaricidas utilizados. A indução do silenciamento gênico se apresenta como uma alternativa biotecnológica para o controle de doenças virais através da utilização de plantas transgênicas que expressam RNA de fita dupla (dsRNA) com sequências do genoma viral alvo. Nesse estudo, construções genéticas para induzir o silenciamento gênico pós-transcricional (SGpT) contra o CiLV-C foram desenvolvidas como uma alternativa biotecnológica para o controle da LC. Com o intuito de induzir resistência contra os vírus das duas linhagens de CiLV-C encontradas em campo, três regiões com alto perfil de identidade entre as estirpes foram escolhidas como alvo do silenciamento: sequências dos domínios MET e RdRp2 do gene RdRp do RNA1 e do gene p15 do RNA2, da linhagem SJP, uma vez que é a linhagem prevalente no cinturão citrícola. As construções foram desenvolvidas no vetor pHairpin, no qual os fragmentos virais foram inseridos no sentido antisenso e senso, separados por um íntron, que favorece a formação do dsRNA (hairpin). As unidades transcricionais 35S-antisensoíntron-senso-tNos foram inseridas no vetor binário pCAMBIA2300 e posteriormente transformadas em Agrobacterium tumefaciens GV3101. Trinta e oito linhas de Arabidopsis thaliana transgênicas foram obtidas mediante a transformação por floral dip (eficiência de transformação 0,07%-0,49%). Seis plantas T1 de treze linhagens foram infestadas com ácaros B. yothersi virulíferos para CiLV-C estirpe SJP. Após 12 dias, a carga viral nas folhas infestadas foi avaliada por RT-qPCR com sondas de hidrólise específicas para o gene RdRp viral. Em seis linhas transgênicas (três RdRp-hp, uma MET- hp e duas p15-hp) evidenciou-se redução na carga viral de 94,5-100% (p<0,05) em quatro linhas (uma RdRp, duas MET-hp e uma p15-hp) de 61-76,7% e em duas linhas p15-hp as cargas virais foram menos drasticamente reduzidas (35,8% e 14,4%) com relação às observadas nas plantas selvagens. Um único evento transgênico (p15-hp) apresentou aumento de 16% no acúmulo viral quando comparado com plantas não transformadas, no entanto não houve diferença estatística deste evento com as plantas selvagens. Os resultados em arabidopsis, hospedeira experimental tanto do vírus quanto do vetor, confirmam que a abordagem da indução do SGpT contra o CiLV-C é viável para o controle da infecção por esse kitavírus.