Padronização da Semi-Nested PCR e PCR em Tempo Real para detecção e quantificação do vírus da Mamilite Herpética Bovina

Abstract

A mamilite herpética bovina, (bovine herpetic mammillitis, BHM), é uma doença vesicular e erosiva, cujo agente etiológico é o BoHV-2. Possui como propriedade a capacidade de estabelecer e reativar infecções latentes. As lesões de mamilite podem ser confundidas com outras infecções de pele, como as causadas pelo vírus pseudocowpox e pelo vírus vaccínia. Já foram desenvolvidos métodos para amplificar regiões de genes para uso em PCR com o objetivo de detectar BoHV-2, e apesar da eficiência há poucos trabalhos com o uso de técnicas moleculares para sua detecção. Como os sinais clínicos são inconclusivos objetivou-se padronizar e validar os métodos moleculares seminested PCR (snPCR) e PCR em tempo real (qPCR), com a finalidade de fortalecer o diagnóstico laboratorial para doenças vesiculares, em apoio aos atendimentos dos Serviços de Defesa Sanitária Animal. Para a padronização, a cepa de vírus BoHV-2 mantida, na coleção do Laboratório de Viroses de Bovídeos do Instituto Biológico foi analisada pelos dois métodos. A sensibilidade analítica da snPCR para BoHV-2 foi de 1x10º cópias de DNA/µL, porém com a desvantagem de maior o risco de contaminação cruzada, enquanto que na qPCR, a sensibilidade analítica foi de 1x10⁰ cópias de DNA/µL, com eficiência de 1,9 e Slope de 3,4, com menor risco de contaminação e maior especificidade. Ficou evidenciado melhor desempenho da qPCR, devido à melhor eficiência, ou seja, menor custo e tempo, comparada com a snPCR. Foram testadas 193 amostras para BoHV-2 e 22 apresentaram resultado positivo tanto na snPCR quanto na qPCR, das positivas em 13 foi detectada coinfecção com os vírus vaccínia bovina e parapoxvirus. As amostras positivas ao BoHV-2 foram sequenciadas apresentando similaridade acima de 90%, com o gene da glicoproteína B herpética depositada no GenBank. Exames laboratoriais complementares devem ser usados para diferenciar os casos de doenças vesiculares detectadas clinicamente, sendo importante a inclusão da qPCR em apoio nas investigações de suspeitas, ampliando assim o escopo do diagnóstico laboratorial de doenças vesiculares e na vigilância virológica do BoHV-2. Conclui-se que o BoHV-2 é endêmico no Brasil, provocando lesões em tetos de vacas e por esse motivo deve ser incluído na lista de agentes investigados para confirmação do diagnóstico de doenças vesiculares a vírus, em apoio às ações do Programa Nacional de Erradicação de Febre Aftosa.