Diagnóstico molecular retrospectivo de febre catarral maligna em bovinos

Abstract

Febre Catarral Maligna (FCM) doença viral aguda, pansistêmica, de distribuição geográfica ampla, geralmente fatal, afeta principalmente bovinos e cervídeos. São conhecidas dez espécies de vírus do grupo da FCM, todos Herpesvirus, famíla Gammaherpesvirinae, gênero Macavirus. A principal no Brasil é FCM ovino-associada, induzida pela cepa herpesvírus ovino-2 (OvHV-2). Por ser confundível com encefalites/encefalopatias e febre aftosa, há a necessidade do diagnóstico diferencial, sendo que os métodos moleculares permitem, em tempo oportuno, identificar os focos e avaliar a situação epidemiológica desta doença no Brasil. Contudo, esses ainda não estão disponíveis na rotina laboratorial para detectar o agente causador da FCM. Por esse motivo, objetivou-se avaliar métodos de extração tanto para material in natura como parafinado; padronizar e validar métodos moleculares de diagnóstico (PCR qualitativa e quantitativa) para o OvHV-2, realizar a análise retrospectiva de amostras de sistema nervoso central de bovino do Brasil e isolar o OvHV-2 em cultura celular. Foram avaliados três protocolos de extração de material in natura, cinco kits comerciais e dois protocolos recomendados pela literatura para extração de material emblocado em parafina. Realizou-se a análise retrospectiva de 290 amostras de sistema nervoso central de bovinos, com diagnóstico clínico de transtorno neurológico, avaliado seguindo critérios clínicos definidos no formulário síndrome neurológica (FORM SN), sendo que as mesmas amostras encontravam-se in natura e emblocadas em parafina. O Trizol® foi o protocolo mais eficiente para a extração de material in natura, pois apresentou reprodutibilidade e repetibilidade. Para material parafinado a extração mais efetiva utilizou o xilol aquecido a 65°C para desparafinização, digestão enzimática com o detergente SDS combinado com a proteinase K, purificação por fenol/clorofórmio e precipitação em isopropanol, porém este método não apresentou reprodutibilidade. A sensibilidade da PCR qualitativa para OvHV-2 foi de 101 cópias de DNA/µL e da qPCR de 100 cópias de DNA/ µL, tanto sistema SYBR®Green como TaqMan®. Das 290 amostras de SNC analisadas, 4,8% (14/290) foram positivas na PCR qualitativa e 5,86% (17/290) na qPCR, a discordância da porcentagem de positividade é, possivelmente, devido a diferença de sensibilidade entre as técnicas. Foram confrontados os resultados da PCR e histopatológico sendo que 47,05% (8/17) apresentaram lesões e alterações histológicas sugestivas de FCM (infiltrado inflamatório mononuclear e manguito perivascular mononuclear). Não obteve-se sucesso no isolamento do OvHV-2 em cultura de células MDBK. O limiar de detecção das técnicas moleculares foi satisfatório, portanto indicadas na rotina laboratorial. No sequenciamento e análise filogenética das amostras positivas, verificou-se tratar-se de OvHV-2 semelhante aos circulantes no mundo. Os achados confirmam a necessidade de provas de diagnóstico específicas e sensíveis para identificação do agente da FCM nos casos de transtornos nervosos, já que não houve concordância entre os achados histopatológicos e moleculares, levando a resultados falso negativos quando é realizada apenas a análise histológica. Baseado nesse conhecimento será possível fazer a vigilância sanitária efetiva e evitar as consequências socioeconômicas, contribuindo assim para oferta sustentável de alimentos suficiente.