Vigilância epidemiológica de doenças do sistema nervoso central em bovinos: diagnóstico do herpesvírus bovino

Abstract

As encefalites são lesões inflamatórias do Sistema Nervoso Central (SNC) que podem ser causadas por diversos agentes, priônicos, virais, bacterianos, parasitários e por outros não infecciosos. Considerando que o Brasil situa-se entre os maiores exportadores de carne bovina, necessita fortalecer o sistema de vigilância epidemiológica das doenças do SNC, realizando o diagnóstico diferencial das encefalites e encefalopatias a fim de fornecer informações epidemiológicas para o Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros e Outras Encefalopatias (PNCRH). Dentre os agentes a serem incluídos, destaca-se os herpesvírus bovino 1 e 5 (BoHV-1 e 5), tendo em vista que o BoHV-5 é o agente causador da meningoencefalite herpética bovina e por ser uma doença frequentemente descrita no Brasil. Objetivou-se 1) padronizar a PCR em tempo real quantitativa multiplex (qPCR multiplex) para o BoHV-1 e 5, 2) avaliar a sensibilidade analítica, 3) diagnosticar a ocorrência do BoHV-1 e 5 em amostras clínicas de SNC e 4) comparar os resultados obtidos com a nested PCR convencional. A curva padrão da qPCR multiplex foi construída a partir do produto de PCR purificado. Amplificou-se a região do gene da UL30, utilizando sondas marcadas com fluoróforos FAM e VIC, respectivamente para o BoHV-1 e 5. Utilizou-se como controle positivo para o BoHV-1 a cepa de referência Los Angeles, e para o BoHV-5 uma amostra isolada e caracterizada pelo Laboratório de Viroses de Bovídeos. Foram analisas 268 amostras clínicas de SNC, correspondentes ao período de janeiro de 2012 a janeiro de 2014, com diagnóstico negativo para a raiva na imunofluorescência direta e prova biológica. Selecionou-se diversas regiões do SNC de cada amostra e o DNA total foi extraído pelo método de TRIzol®, a qualidade do DNA extraído foi avaliada pela reação de PCR em tempo real para a região do gene 16SrRNA do DNA mitocondrial. As amostras foram submetidas à técnica de nested PCR convencional em ensaios separados para BoHV-1 e 5. A repetibilidade e reprodutibilidade foi demonstrada avaliando-se a curva padrão em triplicata e em cinco ensaios diferentes. A sensibilidade analítica da qPCR multiplex foi 101 cópias de DNA/µL para o BoHV-1 e 5. Detectou-se 3,35% (9/268) de animais positivos ao BoHV-5 e nenhuma amostra positiva ao BoHV-1, ainda que o controle positivo padrão tenha funcionado adequadamente. Observou-se concordância entre os resultados obtidos nas duas técnicas. A quantificação da carga viral nas amostras clínicas variou com concentrações de 101 a 104 cópias de DNA/µL. Obteve-se sucesso na padronização da qPCR multiplex que demonstrou ser tão sensível quanto a nested PCR, e a vantagem sobre a nested PCR por ser uma técnica rápida e com menor risco de contaminação. A ocorrência do BoHV-5 foi maior em animais na faixa etária de 12 a 24 meses de idade, corroborando com outros autores. A rapidez da qPCR multiplex no diagnóstico do BoHV-5 permite a confirmação molecular da presença deste agente em tempo oportuno, destacando-se a importância da análise conjunta de dados clínico epidemiológicos, achados histopatológicos e isolamento viral do agente causal, a fim de realizar o diagnóstico diferencial e contribuir com o sistema de vigilância de síndrome neurológica.