Impacto do vírus da língua azul na produção in vitro de embriões bovinos

Abstract

O vírus da língua azul (bluetongue virus, BTV), membro da família Reoviridae, gênero Orbivírus, é transmitido aos ruminantes domésticos e silvestres por Culicóides. Embora bovinos sejam assintomáticos, apresentam-se como importantes reservatórios na cadeia epidemiológica da doença. Em fêmeas gestantes virêmicas, o BTV pode atingir oócitos e embriões, o que pode justificar imposição de barreira sanitária por países importadores de animais e material genético. A presença do agente em células embrionárias associada à zona pelúcida ou aos fluidos que o envolvem pode resultar em perdas diretas do embrião durante a PIVE, e risco de infecção e abortamento à receptora. O objetivo deste trabalho foi avaliar o impacto da infecção experimental por BTV em embriões produzidos in vitro e desenvolver protocolo de ensaio para certificação de embriões livres deste agente. Para tanto, foram testados todos os insumos de origem animal envolvidos na produção in vitro de embriões (PIVE), além de infectar oócitos em maturação com diferentes diluições virais de BTV-4, com título 105 /100µL (10-1 à 10-8 ), analisar os efeitos no desenvolvimento do embrião por meio de microscopia óptica em todas as etapas do cultivo e avaliar por RT-qPCR os procedimentos de lavagens recomendados pela IETS. Os resultados obtidos na RT-qPCR nas amostras, colhidas durante o procedimento da PIVE, como oócitos não fecundados e embriões degenerados, extraídas com Trizol, foram positivos nos grupos que receberam doses virais 10.000 TCID50 / 100 µL (diluição 10-1 ) à 1 TCID50 / 100 µL (10-5) , e o grupo que recebeu 0,1 TCID50 / 100 µL (10-6 ) foi identificado como inconclusivo e os que receberam 0,01 TCID50 / 100 µL (10- 7 ) e 0,001 (10-8 ) apresentaram resultados negativos. Quando o mesmo protocolo foi aplicado às mesmas amostras, variando apenas o método de extração, com BEADS magnéticas, o resultado foi similar, exceto na amostra inconclusiva que passou a ser positiva na diluição 10 -6 . Foram evidenciadas, nos grupos que receberam maior carga viral, alterações morfológicas, como aumento do espaço entre as células, clivagens assimétricas, com granulações, quando comparadas ao grupo controle. As lavagens preconizadas no manual da IETS, sem tripsina, não foram eficazes para impedir a multiplicação do BTV nos grupos experimentalmente infectados. Portanto, recomenda-se análise de amostras colhidas, em pontos críticos, para certificação de partidas de embrião livres do BTV. A validação deste protocolo será uma ferramenta útil para as autoridades sanitárias e profissionais da área, nas negociações dos acordos comerciais entre países para certificação de partidas de embriões livres de BTV-4, que além de evitar perdas diretas devido ao baixo desempenho da PIVE quando algum insumo estiver contaminado, garantirá o comércio seguro de embriões. Essas medidas incluídas nos protocolos sanitários de transferência de embriões bovinos vão fortalecer o setor e permitir a abertura de mais mercados internacionais.