Carga viral das estirpes de citrus leprosis virus C e seu potencial impacto na epidemiologia da leprose dos citros

Abstract

A leprose dos citros (LC) é a doença viral que mais afeta a citricultura brasileira. Embora causada por diferentes patógenos, o cilevírus citrus leprosis virus C (CiLV-C) é o agente prevalente no país. Duas linhagens deste vírus, CiLV-C_SJP (São José do Rio Preto) e CiLV-C_CRD (Cordeirópolis), têm sido identificadas nos pomares comerciais do cinturão citrícola brasileiro, situado nos estados de São Paulo e Minas Gerais. Os sintomas característicos da infecção por CiLV-C são manchas necróticas e/ou cloróticas localizadas nos frutos, ramos e folhas principalmente de laranjeiras doce (Citrus x sinensis L. Osbeck). A estirpe CiLV-C_SJP foi identificada pela primeira vez no Estado de São Paulo em 2016. Após o sequenciamento do seu genoma e estabelecimento de um método específico de detecção, percebeu-se que a estirpe SJP é prevalente dentro do cinturão citrícola, mas ausente das outras áreas de produção de citros no Brasil e no exterior. Visando contribuir e esclarecer as bases moleculares desta distribuição diferencial das estirpes, o objetivo deste trabalho foi estudar a carga viral das estirpes SJP e CRD mediante a quantificação absoluta do genoma viral nos tecidos de frutos e folhas de laranjeiras doce. Para isso, foi desenvolvido um método de detecção baseado em PCR quantitativo com sondas de hidrólise (RT-qPCR). Os iniciadores e as sondas foram desenhados tomando em conta a variabilidade genética reconhecida em mais de 70 isolados virais das duas estirpes. Para o desenvolvimento e a caracterização do método foram construídas curvas padrão para cada estirpe utilizando plasmídeos recombinantes. Os iniciadores específicos para os segmentos alvo dentro do gene RdRp das estirpes SJP e CRD foram validados mediante RT-PCR de ponto final e RT-qPCR com fluoróforos intercalantes. Por fim, o método RT-qPCR por sondas de hidrólise demonstrou ter alto coeficiente de determinação (> 0,9) e eficiências de amplificação de E= 1,0 e E= 0,99 para as estirpes CRD e SJP, respectivamente. Duzentas e quatorze amostras de frutos de laranjas doce com sintomas de leprose, coletadas entre 2017 e 2022 em pomares comerciais ou não, e 140 lesões obtidas de folhas de diferentes locais foram avaliadas mediante ensaios de RT-qPCR com sondas específicas. Observou-se que a estirpe SJP alcança um acúmulo de até nove vezes mais moléculas virais que a CRD, e sua carga viral nos frutos é ao menos três vezes superior que em folhas. Baseado nesses resultados, discutiu-se a possível vantagem adaptativa da estirpe SJP e a sua relação com a epidemiologia do CiLV-C. O estudo provê, ainda, dados que podem contribuir com a compreensão da interação das estirpes de CiLV-C com as variedades de copa e sua relação com possíveis fatores agroambientais dos diferentes setores do cinturão citrícola de São Paulo e Minas Gerais.